《ACS Nano》纳米颗粒治療糖尿病患者皮膚慢性病和非愈合性角膜炎
2014年全世界糖尿病成年生齿有4.22亿。糖尿病有很多并發症，如糖尿病足溃疡和糖尿病性角膜病变、乃至可能致使截肢、目力损失、增长灭亡危害。糖尿病足溃疡是典范的慢性伤口，其得病率為6.3％，并致使皮膚复病發，從而耽误糖尿病醫治時候。非愈合性角膜炎也是常见并發症，在糖尿病患者中病發率很高（47-64％）。這两種糖尿病并發症均可能源于平常糊口中不测的上皮毁伤，上皮愈合能力不足會增长微生物傳染危害，特别是细菌傳染的危害。抗生素可醫治微生物傳染，但滥用致使其耐藥性增长，并促成微生物進化。在大大都伤害的病原體中，多藥耐藥（MDR）细菌包含广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（ESBL E大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），對大眾康健構成為了极大的威逼，出格是對糖尿病患者，這两種病原體致使治愈體系不竭恶化、威逼生命。浙江大學與浙江大學第二從属病院互助配合在ACS Nano颁發了“Light-Activatable Synergistic Therapy of Drug-Resistant Bacteria-Infected Cutaneous Chronic Wounds and Nonhealing Keratitis by Cupriferous Hollow Nanoshells.”作者合成為了具备两重用處的空心核-壳异质布局的AuAgCu2O NSs纳米颗粒，搀杂金銀纳米颗粒可将其吸取峰调解到近红外，金銀合金纳米颗粒可以具备光热效應，激光辐照致使纳米颗粒四周高温，使细菌灭亡。這类金銀合金纳米颗粒具备醫治耐藥性傳染潜力。铜离子是伤口愈合的首要身分，如角卵白和胶原卵白，血管天生和引诱血管内皮發展因子。铜离子局部開释可促成伤口愈合（流程1）。這类抗菌制剂還可以或许革除MDR细菌傳染。纳米凝胶可以促成MDR细菌傳染的糖尿病小鼠慢性伤口和非愈合性角膜炎的上皮再生。流程1：近红外（NIR）活化的AuAgCu2O NSs具备抗菌性，可杀死细菌并改良伤口愈合。
一、AuAgCu2O NSs的制备與表征。
作者将Cu2O纳米壳包裹在AuAg核四周以合成AuAgCu2O NSs（圖1a）。在扫描電子显微镜（SEM）和透射電子显微镜（TEM）（圖1b-c）中，核-壳型纳米管具备平均的描摹，而且Cu2O壳的概况是粗拙的，带有纳米级崛起，核壳布局较着，AuAg核具备中空布局（半径13 nm），Cu2O壳层布局致密（半径23 nm）。與圖1m中AuAg（91 nm）和AuAgCu2O NSs（190 nm）的流體動力學直径散布大致吻合。单個AuAgCu2O纳米颗粒的HRTEM圖象（圖1e）显示界面上的AuAg和Cu2O的晶格条纹别离存在0.236和0.246 nm的間距，Cu2O平面在AuAg晶面上外延發展。HAADF-STEM成像（圖1f）显示核壳尺寸和界面布局。元素映照圖（圖1g-k）表白该纳米運彩最低投注，颗粒含Au，Ag，Cu和O元素。EDS線扫描元素阐發與元素圖谱成果一致（圖1f）。
圖1：AuAgCu2O NSs的夹杂空心核-壳异质布局表征。
二、AuAgCu2O NSs的光热相干性子及其在激光辐照下的功效性离子開释。
作者經由過程调理中空的AuAg核直径和Cu2O壳厚度優化AuAgCu2O NSs的光學性子。與AuAg核比拟，AuAgCu2O NSs的可吸取光吸取范畴到达近红外808 nm（圖2a）。因為等离激元共振取决于颗粒的厚度，Cu2O壳引發SPR峰红移，供给了近红外吸取峰，這可引诱NIR光热转换。作者還經由過程调理颗粒的浓度和激光功率密度来调理AuAgCu2O NSs的光热效力（圖2b-d）。AuACu2O NSs的温度在5分钟内敏捷升高至51.2°C（圖2e）。AuAgCu2O NSs的光热转化效力為57％（圖2f）。AuAgCu2O NSs具备優秀的光不乱性，在2.55 W/cm2的激光照耀5個轮回後吸取没有低落，并保持恒定的光热转换效力。與无激光處置的AuAgCu2O NSs比拟，激光照耀致使AuAgCu2O NSs溶液中的Ag和Cu离子開释量增长（圖2g，h），超小尺寸Cu2O崛起的和光热效應可以促成Cu和Ag离子開释。
圖2：AuAgCu2O NSs的光热相干特征。
三、對耐藥细菌的體外抗菌活性。
作者選擇两種MDR细菌菌株（广谱β-内酰胺酶陽性的大肠杆菌（ESBL E. coli）和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA））對纳米颗粒的抗菌性举行评估。不管是不是有激光處置，AuAgCu2O NSs對按捺细菌滋生的能力都比銀纳米粒子（Ag NPs）强（圖3a-c）。作者還测定了菌落構成单元（CFU）并阐發存活率（圖3d-e）。通例的Ag NP和NIR激光照耀没有协同感化，只能少许削减菌落数，AuAgCu2O NSs可以或许大幅度削减菌落数。AuAg核的中空布局與通例Ag NPs比拟具备较强的Ag离子開释。同時，在激光照耀的辅助下，AuAgCu2O NSs可以經由過程PTT和Ag离子的開释進一步介导协同抗菌感化，從而有用地杀死所有耐藥细菌。
圖3音波拉皮，：AuAgCu2O NSs PTT體外杀菌機能评估。
四、细菌完备性粉碎的评估。
接着，作者利用SYTO9/PI Live/Dead荧光染色實验阐發了分歧處置法子時ESBL E. coli的膜完备性。在圖4a中，比照组和通例Ag NP加激光组中，只有一部門ESBL E. coli可以被染色，无激光照耀的AuAgCu2O NSs中的很多ESBL E. coli的死细胞（赤色旌旗燈号）。激光+AuAgCu2O NSs處置几近杀手所有ESBL E. coli。在激光處置以前，ESBL E. coli和MRSA两種细菌菌株均连结完备的滑腻概况和典范的棒状/球形外形（圖4b-c）。激光+AuAgCu2O NSs處置紧张粉碎了ESBL E. coli细胞，扭曲了原始形态，并在细菌细胞壁/膜上有清楚的毁伤和孔洞（圖4b）。同時，激光+AuAgCu2O NSs處置後，在MRSA细菌概况察看到大量的纳米颗粒。激光醫治有用地促成了抗菌感化，并致使细胞壁的消融及细菌灭亡（圖5a，b）。在激光處置後，AuAgCu2O NSs在ESBL E. coli细胞质部門構成汇集體（圖5a），激發内部永恒性毁伤，出格是對DNA份子和功效卵白的毁伤。而AuAgCu2ONSs在MRSA外膜概况構成汇集體（圖5b）。這类集中的加热基质進一步提高特定區域的局部浸透性，并促成AuAgCu2O NSs進入细胞，加快细菌灭亡。
圖4：AuAg治療濕疹,Cu2O NSs PTT處置的细菌的外部细胞布局变形。
圖5：AuAgCu2O NSs PTT粉碎原细菌内部细胞布局。
五、抗生物膜活性。
生物膜對细菌的附着和增殖相當首要。圖6a中，AuAgCu2O NSs在必定水平上削减了生物膜的構成，而激光增强了该功效，而銀纳米粒子+激光處置只是稍微按捺了生物膜的發生。激光+AuAgCu2O NSs處置後的两種细菌的生物膜最薄、最希罕，正常细菌具备密集而完备的生物膜布局。SEM圖象（圖6b）也证了然激光+AuAgCu2O NSs處置對生物膜的毁伤。這类AuAgCu2O NS不但有抗菌性，還會發生热量，直接粉碎细胞壁、卵白质和DNA份子，可彻底杀死任何细菌，包含MDR细菌。
圖6:AuAgCu2O NSs PTT對细菌菌群生物膜的影响。
六、AuAgCu2O NSs的體外举動。
作者選擇人角质構成细胞（HaCaT）和人角膜上皮细胞（HCEPC）举行體外划痕實验，以确認Cu离子在改良皮膚组织修复中的感化。激光+AuAgCu2O NS處置未對上皮和内皮细胞發生细胞毒性（圖7a-c），阐明AuAgCu2O NSs具备高生物相容性。激光+AuAgCu2O NS處置後，两種细胞系均表示出最强的迁徙能力（圖7d，f）。跟着铜离子的開释，HACAT和HCEPC的迁徙率别离约為69.04和65.87％，為Ag NP處置组的4倍和2倍。别的，作者举行了Matrigel阐發以摹拟结缔组织膜顶部的内皮细胞（人脐静脉内皮细胞，HUVEC）的血管天生。AuAgCu2O NSs不管有没有激光處置，體系中的细胞舒展到分支结點，構成慎密的毗连，平行的细胞系和網状圈，這是血管天生後期的典范指征（圖7h）。
圖7：AuAgCu2O NSs PTT在體外促成上皮和内皮的再生機能。
七、對MRSA傳染的皮膚伤口模子的體内抗傳染成果的评估。
作者将AuAgCu2O NSs與透明质酸钠水凝胶夹杂，该基质還可在特定區域内供给延续開释，到达精准醫治的目标。激光+AuAgCu2O NS處置的小鼠的伤口區域温度升高（圖8a，b）。伤口處的温度可能到达40°C，但不會造成较着的正常组织毁伤。在第8天，（圖8c，d），激光+AuAgCu2O NS醫治的小鼠創伤面积变小，规复率约為93.5％。未利用激光照耀的AuAgCu2O NSs或利用激光+Ag NPs醫治的规复率别离為67.0和49.7％。H＆E染色成果（圖8e）表白，比照组的组织切片显示有大量浸润性炎症细胞。但是，激光+AuAgCu2O NS處置後炎性细胞很少。
圖8：AuAgCu2O NSs水凝胶PTT對皮膚伤口的體内抗傳染成果。
八、MRSA體内傳染性并發症模子促成皮膚伤口愈合。
激光+AuAgCu2O NSs處置12天後彻底清除MRSA傳染并治愈了伤口（圖9a，b）。從圖9c，d可以看出，激光+AuAgCu2O NSs處置後，胶原组织的間隙最短（0.43 妹妹），而在其他组中發明大間隙和正常血管组织（比照组：3.35妹妹，Ag +激光组：3.27妹妹，AuAgCu 2 O组：1.45妹妹）。
圖9：AuAgCu2O NSs水凝胶PTT對非愈合伤口的愈合成果。
九、對MRSA傳染角膜炎的抗傳染和促成愈互助用。
除皮膚傳染外，细菌性角膜炎是糖尿病患者的@另%2DT8o%外%2DT8o%一大恶%7184T%梦@，它可侵害目力。作者經由過程創建糖尿病小鼠MRSA傳染性角膜炎模子来评估纳米凝胶在醫治中的成果。激光+AuAgCu2O NSs處置使角膜伤口區域的局部温度升高，最高到达40°C（圖10a，b）。因為具备抗菌（新冠肺炎檢測試劑,發生热量并開释出銀离子）和愈合（開释出铜离子）的结果，激光+AuAgCu2O NSs處置25天乐成解除MSRA傳染并促成角膜规复（圖10c）。
圖10：AuAgCu2O NSs水凝胶PTT在超等细菌傳染的角膜炎中的抗傳染和促成愈合成果。
十、促成伤口愈合的潜伏旌旗燈号通路。
局部皮膚伤口缺氧可能影响愈合，缺氧引诱因子-1（HIF-1）作為氧稳态的重要调理器，是愈合進程中的關头身分。從圖11a和c中可以看出，在比照组和Ag +激光组中，HIF-1α几近可以疏忽不计（密度均匀值8.95），AuAgCu2O NSs中的HIF-1α含量更高（密度均匀值12.3），激光+AuAgCu2O NSs组的HIF-1α含量進一步增长（密度均匀值19.4）。激光+AuAgCu2O NSs组的血管内皮發展因子（VEGF）是比照组的2.65倍（圖11a-e）。一样，激光+AuAgCu2O NSs组與其他组比拟，皮膚伤口中發生的血管数目较着增长。AuAgCu2O NSs在激光照耀下開释铜离子，增长HIF-1α表达（圖11k）。血管再生相干细胞数目增长，并在皮膚重整進程中發生更多血管，终极改良伤口愈合。
圖11：促成角膜伤口愈合的潜伏旌旗燈号通路。
十一、開端毒性评估。
在全部PTT醫治中（延续30天），醫治小鼠的體重不乱（圖12a）。别的，PTT醫治後肝和肾的功效连结正常（圖12b-e）。该療法對血液没有任何影响（圖12f-o），這與早教玩具推薦,重要器官的组织學阐發类似（圖12p）。
圖12：開端毒性测定。
1二、结论
作者提出了一種两重用處的AuAgCu2O纳米凝胶，它可以對傳染了MDR细菌的慢性伤口和非愈合性角膜炎举行多级醫治。AuAgCu2O NSs可以或许在NIR激光照耀下延续開释Ag / Cu离子并發生热量，這可以有用地粉碎细菌并帮忙伤口愈合。别的，以凝胶為支架，激光+AuAgCu2O NSs可以經由過程加热，開释Ag离子、開释Cu离子在病变内發生协同而切确的醫治。這类醫治可有用解除ESBL E. coli和MRSA，并促成皮膚慢性伤口和角膜规复。這类AuAgCu2O纳米凝胶在醫治進程中没有较着的细胞毒性。此钻研為醫治與MDR傳染相干的慢性伤口和非愈合性角膜炎供给了壮大的平台，這為未来的設計供给参考并促成该范畴的临床醫治。
参考文献：DOI: 10.1021/acsnano.9b08930
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